Badania czystości mikrobiologicznej

Badaniom czystości mikrobiologicznej poddawane są nie tylko surowce i produkty końcowe, ale również personel i środowisko produkcyjne, a więc powietrze, pomieszczenia, urządzenia oraz wykorzystywane media (woda oczyszczona, sprężone powietrze itp.).

Rozwój mikrobiologii, chemii, biochemii, biofizyki, immunologii oraz innych dyscyplin przyczynił się do ulepszenia metod izolacji, wczesnego wykrywania, liczenia, charakterystyki i identyfikacji drobnoustrojów. Tradycyjne metody stosowane w mikrobiologii są wieloetapowe i czasochłonne. Dlatego do praktyki mikrobiologicznej wprowadza się coraz więcej szybkich metod oznaczania i identyfikacji drobnoustrojów.

W myśl rozporządzenia 2073/2005 z dnia 15 listopada 2005 r. w sprawie kryteriów mikrobiologicznych dotyczących środków spożywczych z późniejszymi zmianami, przedsiębiorstwa sektora spożywczego powinny mieć możliwość wykorzystywania metod analitycznych innych niż metody referencyjne, szczególnie tzw. szybkich metod. Oczywiście, o ile ich wykorzystanie daje równoważne wyniki.

Szybkie testy mikrobiologiczne można podzielić na następujące grupy:

– Metody mikroskopowe i pochodne
– Metody oparte o reakcje biochemiczne
– Metody oparte o reakcje immunologiczne

Ze względu na ich bardzo szeroki wachlarz, w niniejszym artykule przedstawione zostaną tylko niektóre z nich.

1. Metody mikroskopowe – modyfikacje metody płytkowej Kocha

Tradycyjna metoda Kocha polega na wysianiu odpowiednio rozcieńczonej zawiesiny drobnoustrojów na pożywkę stałą, a następnie inkubacji i liczeniu wyrosłych kolonii. Metoda ta doczekała się wielu modyfikacji, mających na celu ograniczenie czasochłonności i pracochłonności.

Rodzajem takich modyfikacji są różnego rodzaju gotowe zestawy z podłożami naniesionymi na plastikowe paski bądź płytki. Przykładem są płytki Compact Dry firmy R-Biopharm, na które nanosi się rozcieńczona próbkę i inkubuje w określonych warunkach. Płytki mogą być również wykorzystywane w metodzie odciskowej, wymazowej oraz metodzie z użyciem filtrów membranowych. Liczenie wyrosłych kolonii oraz ich identyfikację ułatwia zastosowanie chromogennych substratów oraz wskaźników redoks.

Na rynku dostępne są również gotowe zestawy łopatkowe, składające się z łopatki pokrytej po obu stronach jedną, dwoma lub trzema pożywkami agarowymi, selektywnymi dla różnych grup mikroorganizmów.

Pobranie prób odbywać się może na trzy sposoby:

– zanurzenie paska z pożywką w badanej próbce,
– pocieranie powierzchni pożywek wymazem z badanych powierzchni,
– zaszczepienie kontaktowe poprzez docisk do badanej powierzchni.

Po pobraniu próbek, płytki należy umieścić w fiolce i inkubować w warunkach określonych dla danego rodzaju drobnoustroju. Wynik odczytuje się poprzez porównanie wzrostu bakterii ze wzorcami płytek o znanej liczbie kolonii.

Dużą popularnością cieszą się również Petrifilmy produkowane przez firmę 3M. Składają się one z papierowej podstawy, podzielonej na kwadraty i pokrytej warstwą polietylenu, na którą naniesiona jest pożywka hodowlana (agar odżywczy, podłoże wybiórcze itp.) oraz przezroczystej folii propylenowej, zawierającej czynnik żelujący i barwny wskaźnik.

Na podstawę z wybranym podłożem nanosi się 1 cm3 produktu lub jego rozcieńczenia, przykrywa warstwą foliową, odciska folię specjalnym krążkiem (dyfuzorem), a następnie inkubuje w odpowiednich dla danego drobnoustroju warunkach i zlicza wyrosłe kolonie.

2. Testy biochemiczne

Testy biochemiczne oparte są na określeniu zdolności mikroorganizmów do asymilacji, fermentacji lub rozkładu określonych związków chemicznych. Są to gotowe zestawy miniprobówek zawierających odwodnione pożywki z ewentualnym dodatkiem barwnego indykatora. Zestawy mają kształt plastikowych pasków z owalnymi zagłębieniami lub mikropłytek, zawierających kilka rzędów wgłębień w postaci celek, do których wprowadza się zawiesinę biomasy czystej populacji identyfikowanego drobnoustroju. W celu wytworzenia warunków beztlenowych powierzchnię celki po zaszczepieniu pokrywa się warstwą parafiny.

Przykładem tego rodzaju testów są testy API produkowane przez firmę bioMerieux. W ofercie znajdują się testy pozwalające na identyfikację m.in. patogenów należących do rodzajów Listeria, Staphylococcus, Streptococcus, bakterii z rodziny Enterobacteriaceae oraz drożdży.

Czas inkubacji zestawu wynosi zwykle od 18 do 48 godzin. Test RapiD 20 E pozwala na identyfikację 61 gatunków bakterii z rodziny Enterobacteriaceae w czasie ok. 4 godzin. Nazwę gatunku identyfikowanego ustroju odczytuje się z właściwej dla danego zestawu książki kodowej lub za pomocą programu komputerowego APILAB plus – po wprowadzeniu wyników testu w postaci numerycznej.

Do szybkiej kontroli skuteczności procesów mycia i dezynfekcji powierzchni produkcyjnych wykorzystywana jest metoda oparta na bioluminescencyjnym pomiarze zawartości ATP (adenozyno-5- trójfosforanu). Pozwala ona wykryć nie tylko obecność żywych drobnoustrojów ale również substancji organicznych, będących doskonałą pożywką dla mikroorganizmów.

Poziom ATP mierzony jest w oparciu o reakcję oksydatywnej dekarboksylacji lucyferyny katalizowaną przez enzym lucyferazę. Towarzysząca tej reakcji bioluminescencja mierzona jest lumenometrem. Zaś wynik podawany jest w jednostkach RLU ? Relative Light Unit. Ilość wydzielanego światła jest proporcjonalna do zawartości ATP.

Dla większości systemów pomiarowych różnych firm opracowane są akceptowalne i nieakceptowalne wartości RLU dla określonej branży przemysłu spożywczego. Dla każdego miejsca pomiarowego należy również ustalić tzw. tło oznaczenia, czyli dopuszczalny poziom ATP wynikający z rodzaju surowca, technologii jego przetwarzania i rodzaju powierzchni. Wartość tę, oznaczaną jako ?pass?, ustala się po oczyszczeniu i umyciu danego punktu.   

Do testów biochemicznych zaliczamy również testy enzymatyczne. Przykładem takiego testu jest EnzQuick. Jest to system oznaczania, składający się z syntetycznych substratów, które w obecności enzymów charakterystycznych dla bakterii chorobotwórczych wywołują reakcję chemiczną. W wyniku tej reakcji  dodanie czynnika wywołującego zmianę koloru powoduje, że na pałeczce wymazowej pojawia się zabarwienie.

Testy EnZquick dostępne są m.in. w wersji umożliwiającej wykrycie bakterii tlenowych Gramm-ujemnych, pałeczek Salmonella oraz ogólnej liczby bakterii.

3. Testy immunologiczne

Metody immunologiczne oparte są na specyficznej reakcji antygen – przeciwciało. Antygen mogą stanowić komórki drobnoustrojów lub ich metabolity np. toksyny.

Szeroką gamę testów immunologicznych stanowią testy aglutynacyjne. Przeciwciała są tu osadzane na barwnych cząsteczkach lateksu. Wprowadzenie specyficznego antygenu wywołuje reakcję immunologiczną pociągającą za sobą wtórną aglutynację, spowodowaną agregacją opłaszczonych cząstek lateksu. Stosowanie barwnego lateksu znacznie ułatwia odczytanie wyniku. Przykładem testów aglutynacyjnych są testy Salmonella Latex Test firmy Oxoid oraz test na obecność Staphylococus aureus produkowany przez firmę BLB Microbiology system.

W metodach immunoenzymatycznych antygeny lub przeciwciała mogą być znakowane enzymami, fluorochromami lub radioizotopami.

W tej grupie dużą popularnością cieszy się technika ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay) i jej wariant Sandwich ELISA – tak zwany test kanapkowy ELISA. W teście tym przeciwciało specyficzne dla danego antygenu zostaje związane z fazą stałą. Antygen wprowadzany z badaną próbką zostaje związany z przeciwciałem i unieruchomiony na nośniku. Po wymyciu niezwiązanych antygenów, wprowadza się kolejną porcję specyficznych przeciwciał oznakowanych enzymem. Reakcja barwna obserwowana jest po dodaniu odpowiedniego substratu.

Najczęściej stosowane enzymy to:

– fosfataza alkaliczna (przekształca bezbarwny fosforan p-nitrofenolu w żółty p-nitrofenol),
– peroksydaza chrzanowa (daje niebieskie zabarwienie w obecności tetrametylobenzydyny),
– oksydaza glukozowa (z kwasem 5-aminosalicylowym daje kolor brunatny).

Przykładem zastosowania testu kanapkowego ELISA jest zestaw Salmonella Unique firmy Tecra Diagnosis, stosowany do wykrywania obecności pałeczek Salmonella. Specyficzne przeciwciała osadzone są tu na krzyżakowej szpatułce, a przeciwciała znakowane enzymem znajdują się w roztworze.

Szybkie testy mikrobiologiczne pozwalają na stworzenie efektywnego systemu monitoringu jakości środków spożywczych dzięki:

– możliwości wykonywania większej liczby analiz i otrzymania wyniku w krótszym czasie,
– stosowaniu systemów mniejszych i tańszych w eksploatacji niż całe laboratorium mikrobiologiczne,
– prostocie wykonania testów.

Podsumowując testy oparte na bioluminescencji lub testy z wykorzystaniem reakcji immunologicznych, pozwalają na uzyskanie wyników podczas realizacji procesu. Natomiast testy ELISA pozwalają wykrywać nie tylko mikroorganizmy, ale także substancje niepożądane np. alergeny. Wykraczają więc one poza granice kontroli mikrobiologicznej i stają się elementem wszechstronnej kontroli jakości produktu.